新型冠状病毒核酸检测中的思维误区，释疑！

摘要

2019 新型冠状病毒( 2019-nCoV )核酸检测是目前最可靠的排查和确认手段,是新型冠状病毒肺炎( COVID-19 )病例确诊的金标准。

由于 2019-nCoV 核酸检测阳性率低,口咽拭子屡次送检阴性,核酸检测结果与临床诊断不吻合,在 COVID-19 病例确诊应用中遇到了一些挑战,出现了众多不同的观点或疑惑,众多讨论集中在 2019-nCoV 核酸检测方法出现漏检和假阴性的问题上,部分专家和一线临床医生提出用临床影像学 CT 检查代替核酸检测的建议。

到底是什么原因导致目前核酸检测“假阴性率”如此之高,解读核酸检测报告中存在哪些思维误区呢?

如何保证核酸检测结果的及时性和准确性,对当前疫情防控具有非常重大的意义,也是现阶段疫情防控的难题。

因此,有必要论述一下造成当前 2019-nCoV 核酸检测假阴性的可能原因,并科学提出有关的应对策略,供相关部门在制定防治策略和开展工作时参考。

自 2020年 1 月 16 日国家卫生健康委员会发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》,2 月 18 日已经更新至“试行第六版”(国卫办医函〔2020 〕 145 号),从诊断标准、临床分型、鉴别诊断乃至重症和轻症的诊疗方案上,都已经出台了更详细的指导办法。

首先应明确最新版(试行第六版)中关于疑似病例和确诊病例的定义。

疑似病例是指有流行病学史,有发热、呼吸道等典型临床症状,具有新型冠状病毒肺炎(COVID-19 ) 影像学特征,初步血常规检查白细胞总数降低,淋巴细胞总数减少这 3 项符合 2 项的情况,或者无流行病学史,这 3 项临床特征全符合的情况,均可以确认为疑似病例,而对于疑似病例,可以进行病毒核酸检测,若呈现阳性,则可以确诊为COVID-19 确诊病例。

随着核酸检测能力大大提升,第六版诊疗方案中取消了临床诊断病例。

目前媒体和专家激烈讨论的 COVID-19 诊疗中核酸检测“假阴性”概念,主要指的是临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎,但 2019 新型冠状病毒( 2019-nCoV )核酸检测屡次或始终为“阴性”。

但对于临床分子检测实验室和核酸检测方法而言,核酸检测“假阴性”则有不同的概念,指的是在所采集样本中存在有足够量的病毒,但却未被检出,而不是上述针对有COVID-19 临床症状患者而言所称的核酸检测结果与临床表现不吻合的“假阴性”。

要清醒地认识到,2019-nCoV 核酸检测的对象是病毒核酸,而非 COVID-19 疾病本身,对出现的假阴性结果要用正确的思维去分析和认识。

COVID-19 诊断是一个综合临床思辨的过程,要充分认识到核酸检测的诸多影响因素,要更多地强调反复多次核酸检测的必要性,更加重视提高检测试剂的敏感性,加强质量控制和规范采集标本,从而提高诊断的阳性率。

1 2019-nCoV 核酸检测的基本原理和条件

2019-nCoV 的遗传物质是单链 RNA ,核酸检测的目标是在患者标本中找到 2019-nCoV 的 RNA ,因此,核酸检测也是临床诊断的重要手段和“金标准”。

对 2019-nCoV 核酸检测主要有两个方法,一种是基因测序,一种是荧光定量 RT-PCR ( Reverse transcri ptionpolymerase chain reaction , RT-PCR )法 。

在疫情初期,面对新的病原体,最先检出的方法是下一代测序技术( Next-generation sequencing ,NGS ),并很快确定了 2019-nCoV 的核酸序列。

在病毒核酸序列确定的情况下,通过对其保守区域进行引物探针设计及靶向荧光定量 RT-PCR 检测,无疑是最为简单及快速的检测策略。

该方法是将标本中的特定 RNA 序列逆转录后进行扩增,理论上每一次扩增后的病毒基因片段数量都是成倍增加,经过 30 次以上扩增后,靶标基因片段达到一定数量即可进行可视检测。

目前 2019-nCoV 核酸检测靶标主要包含病毒基因组中 3 段保守序列,即开放读码框 1ab ( Openreadingframe1ab , ORF1ab )、核壳蛋白( Nucleocapsidprotein ,N )基因以及包膜蛋白(Envelop , E )基因 。

根据国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第五版)》 ,在实验室要确认一个病例为阳性,需满足同一份标本中新冠病毒的 ORF1ab 及 N 基因 2 个特异性靶标基因的实时荧光 RT-PCR 检测结果均为阳性。

若出现单个靶标阳性的检测结果,则需要重新采样,重新检测。

如实验室受选用检测试剂盒的限制,只能检测一个靶标基因,应至少针对 2019-nCoV 最为保守及特异的 ORF1ab 区域进行检测。

阴性结果也不能排除 COVID-19 ,需要排除可能产生假阴性的因素,主要包括:

样本质量差(比如口咽等部位的呼吸道样本);

样本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;

技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR 抑制等。

基于 2019-nCoV 核酸检测的基本原理,在 CO-VID-19 患者标本中检出病毒核酸,需要同时满足以下条件:

(1)留取标本时要采集到含有病毒的细胞。

(2)被感染者的细胞中有达到检测低限的病毒量。

(3)具有方法学性能指标可靠的体外诊断试剂(盒)。

(4)在规范的临床实验室(合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系)开展检测。

核酸检测阳性可以确诊感染;

核酸检测阴性,不能完全排除感染,临床医生应根据临床症状并结合病程多次采样送检,通过病情进展与最终核酸检测结果综合判断确诊或排除疑似。

对于医学观察期间的疑似病例,只要核酸检测多次阴性,就不能诊断为确诊病例。

2 2019-nCoV 核酸检测报告“假阴性”的原因分析

在临床检验中,假阴性是指针对阳性样本检测出阴性结果,而部分媒体报道中的“核酸检测阴性但有症状”问题,是针对患者(临床症状)而言产生的假阴性,并非真正意义上临床检验工作中针对检测样本(病原体核酸)而言的假阴性。

患者是否被 2019-nCoV 感染和核酸检测结果之间不能完全等同,因为在二者之间还存在样本采集、运输、保存、处理、试剂检测、结果分析等一系列环节,可能会对二者之间的关系产生影响。

在 COVID-19 疫情防控中开展的核酸检测,要清醒地认识到,检测的对象是 2019-nCoV 核酸,而非 COVID-19 疾病本身。

送检样本中存在 2019-nCoV ,但核酸检测结果为阴性,是真正临床检验意义上的假阴性。这种情况发生概率极低,如发生,除采样环节和样本处理核酸提取环节外,还可能与以下原因有关。

(1)试剂盒的质量以及质控问题。

由于此次新冠病毒检测试剂盒是在紧急情况下特殊审批的,尚缺乏大量临床试验数据和统一的质控标准。

同时,由于需求量大,目前临床也在使用大量未经批准的、以捐赠等方式获得的试剂盒,这都可能产生由试剂盒质量问题导致的针对检测样本(2019-nCoV 核酸)的假阴性。

(2)临床实验室管理问题。

规范标准的临床实验室管理和操作,是保证检测结果准确可靠的重要因素。

此次疫情防控需大量临床实验室检测,虽然要求实验室有基因扩增临床实验室和生物安全二级实验室资质,但开展检测工作的不同实验室之间能力和水平差距仍较大。

存在不规范的实验室操作导致针对检测样本(2019-nCoV 核酸)假阴性结果的可能性。

患者临床症状符合 COVID-19 ,但 2019-nCoV核酸检测为阴性,为非真正临床检验意义上的假阴性。

目前部分媒体报道的核酸检测“假阴性”,往往指的是这种情况。

产生这种假阴性,可能是以下原因导致。

(1)患者确实未感染 2019-nCoV ,而是由其他病原体感染导致产生类似 2019-nCoV 的症状体征,未能被有效鉴别而被临床诊断 COVID-19 ,但实验室核酸检测阴性。

(2)感染了 2019-nCoV 但未能有效采集、检测到病毒核酸。

能否采集到足够数量的病毒用于检测,与疾病发展的阶段、采集的部位及采集的方法等关系密切。

如患者被病毒感染后,可能会经历一个从无症状到出现症状、再到出现严重症状的病程,体内病毒数量也会随病程变化而发生变化;一些患者鼻咽部病毒含量多,一些口咽部病毒含量多,而少数患者仅能在肺泡灌洗液中才能找到病毒。

因此,需要在病程的不同阶段、不同的采集部位,或通过不同的采集方法,才可能采集到足够数量的病毒用于检测。

但目前临床上主要以口咽或鼻咽等单一部位的拭子进行检测,即使进行不同时间的两次检测,也可能“漏诊”,产生针对 COVID-19 患者(临床症状)的假阴性。

此外,由于部分医务人员采集技术不佳,或即使熟练掌握采集技术但因恐惧导致不能规范开展口咽、鼻咽拭子采集,加大了产生针对 COVID-19 患者(临床症状)假阴性的可能性。

部分媒体报道的“核酸检测阳性但无症状”的情况,常被认为是核酸检测出现了假阳性。

出现这种情况,理论上也可能存在两种情况。

一种是针对COVID-19 患者(临床症状)的假阳性,针对检测样本(2019-nCoV 核酸)的真阳性。患者未被 2019-nCoV 感染,但在样本的采集、运输、保存、处理过程中,产生了污染情况,混入了 2019-nCoV ,而检测出阳性结果。但是,实际上这种假阳性的发生概率较低。

另一种是针对 COVID-19 患者(临床症状)和检测样本均为真阳性。即患者隐匿感染,无明显临床症状,但核酸检测结果为阳性。由于在核酸检测实验过程中,加入了阴性样本进行随机对照,检测出的阳性结果极其可靠。

综上所述,核酸检测阳性结果被视为新型冠状病毒感染诊断的金标准,而阴性结果不能作为排除新型冠状病毒感染的金标准,更不能作为排除新型冠状病毒肺炎的金标准。

3 避免 2019-nCoV 核酸检测报告出现“假阴性”的应对策略

3.1 优化样本采集 

(1)加强检测样本采集人员培训和患者宣教,强化患者配合,规范采集操作。

(2)多部位采集、多种样本混合检测。

每次检测可同时将鼻咽和口咽拭子,以及痰、粪便等不同部位、不同形式的样本,经处理后混合进行一次性检测,提高检测阳性率。

(3)明确采集样本优先次序。

首选痰标本,其次为鼻咽、口咽拭子,再次粪便标本等。

3.2 加强质控管理 

(1)加强对诊断试剂盒的质量控制,确保用于临床检测的试剂盒质量稳定、效果一致。

(2)加强临床实验室的质量控制,通过室内质评、室间质控以及加强操作人员培训等,提高检验能力和水平。

3.3 开发应用新技术 

基于现有痰、口咽拭子、鼻咽拭子以及粪便等的核酸检测,出现针对患者(临床症状)的假阴性结果不可避免,应当开发应用 2019-nCoV 特异性抗原抗体检测技术,作为有益补充。

这将对 2019-nCoV 核酸检测阴性患者提供更多的诊断支持,有效减少针对 COVID-19 患者(临床症状)假阴性结果的产生。

3.4 加强对疑似病例、出院患者的诊断和管理 严格落实对疑似病例诊断和管理的要求,即在定点医院或首诊隔离点单间隔离治疗,减少因核酸检测产生针对 COVID-19 患者(临床症状)的假阴性结果,而放松对潜在传染源的管理,导致新的疾病传播。

对按现有标准排除诊断的疑似病例或出院患者,即使符合两次规范核酸检测阴性要求,仍建议居家隔离观察 2 周,如出现相关症状,及时就诊。

同时,加快 2019-nCoV 特异性抗原抗体检测产品研发和审评审批,有效应用于疑似病例、出院患者的诊断和管理,并对诊疗规范及时进行调整。

来源：王达,董梁,卿松,闫中强. 新型冠状病毒核酸检测中的思维误区[J]. 中华医院感染学杂志,2020,08:1167-1170.

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