非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌发病机制的研究进展
非酒精性脂肪性肝病相关肝
细胞癌发病机制的研究进展
来源：中华消化杂志, 2022,42(3) : 206-209.
肝细胞癌是起源于肝细胞的恶性肿瘤，是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。
世界卫生组织国际癌症研究机构的数据显示，全球恶性肿瘤中肝细胞癌发病率位居第6位，死亡率位居第4位；我国每年肝癌的新发病例近40万，同时有约36.8万的患者因肝癌死亡。
肝细胞癌发生的危险因素主要包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、饮酒、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)等。
随着肥胖及与肥胖相关的代谢综合征的全球性流行，NAFLD和(或)非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)相关肝细胞癌的发病率也显著上升，并逐渐成为肝癌的主要病因之一。
相对于病毒性肝炎相关肝细胞癌，NAFLD和(或)NASH相关肝细胞癌的发生更隐匿，其病灶多为单个且体积较大，患者预后更差，但其具体机制尚不明确。
有研究显示，高达30%的NASH患者可出现肝脏炎症和纤维化，部分患者可进一步发展为肝细胞癌，约1/3的NASH相关肝细胞癌可发生于无肝硬化患者，提示肝纤维化和肝硬化的程度可能影响NASH相关肝细胞癌的进展，但其发病机制与其他病因所致肝癌不完全相同。
临床上尚缺乏针对NASH的有效检测手段和治疗药物，也无预防NAFLD相关肝细胞癌发生的有效手段，因此，加强关于NAFLD相关肝细胞癌发病机制的研究，对于探索早期发现、诊断和治疗NAFLD相关肝细胞癌的药物和手段具有重要意义。
目前认为NAFLD相关肝细胞癌发病机制与遗传、代谢、氧化应激、免疫和肠道菌群失调等因素有关。
本文就近年来NAFLD和(或)NASH相关肝细胞癌发病机制的研究进展进行综述，为进一步的研究和临床诊疗提供思路。
一、遗传因素
1．基因多态性：
全基因组关联研究显示，一系列单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位点与NAFLD发生和疾病进展的风险具有显著相关性。
目前最受关注的SNP位点包括patatin样磷脂酶结构域蛋白3(patatin-like phospholipase domain-containing 3，PNPLA3)基因的rs738409 c．444C>G(p.I148M)位点、跨膜蛋白6超家族成员2(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)基因的rs58542926 c．449C>T(p.E167K)位点和膜结合O-酰基转移酶结构域7(membrane-associated O-acetyl transferase gene 7，MBOAT7)基因的rs641738位点。
PNPLA3p.I148M突变可破坏PNPLA3的泛素化和蛋白酶体降解，导致肝脂滴中甘油三酯的动员受损，引起肝细胞内甘油三酯的蓄积，进而引起肝细胞脂肪变性。
PNPLA3在体外具有视黄醇棕榈酸酯脂肪酶活性，并参与肝星状细胞释放视黄醇。
因此，PNPLA3 p．I148M突变可能通过破坏肝星状细胞释放视黄醇，导致基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子分泌减少，引起细胞外基质沉积、肝纤维化和肝细胞癌。
而肝脏中视黄酸代谢物水平降低可促进巨噬细胞对肝星状细胞的激活。
虽然PNPLA3在NAFLD相关肝癌发生中的作用尚不明确，但PNPLA3 rs738409位点多态性与肝细胞癌显著相关。
2007年一项以瑞典肥胖人群为研究对象的研究发现，携带PNPLA3p.I148M突变的患者罹患肝细胞癌的风险增加了5.9倍。
一项回顾性研究显示，晚期纤维化阶段(Ishak分期为F3或F4期)和纯合PNPLA3p.I148M携带是NASH相关肝细胞癌发生的强预测因子，且PNPLA3p.I148M突变是肝细胞癌的独立危险因素。
TM6SF2 rs58542926 c．499G>A突变导致其编码的TM6SF2 E167K蛋白在肝极低密度脂蛋白分泌途径中的功能丧失。选择性敲除TM6SF2后，小鼠肝脏甘油三酯含量增加3倍，极低密度脂蛋白分泌减少50%。
在TM6SF2 E167K变异体患者中，TM6SF2功能的丧失可能导致肝脏甘油三酯含量增加。虽然部分关于TM6SF2 rs58542926 c．499G>A(p.E167K)在肝癌发生中作用的研究结果相互矛盾，但TM6SF2 E167K变异体被认为与NASH相关肝细胞癌发病机制中的肝损伤有关。
有研究发现MBOAT7基因下游的SNP与MAFLD、炎症和纤维化的风险增加有关，并可能导致肝细胞癌的发生，然而，后续的研究中尚未发现类似的结果。
因此，TM6SF2 rs58542926 c．449C>T(p.E167K)和MBOAT7 rs641738位点在NAFLD相关肝细胞癌进展中的作用有待进一步研究。
2．表观遗传调控改变：
表观遗传调控改变指在不改变DNA本身的情况下，通过DNA的甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控使基因表达发生可遗传的改变，这种变化可改变DNA转录的能力。
近年来，DNA甲基化、非编码RNA调控在NAFLD相关肝细胞癌进展中的作用得到了广泛研究。
Dreval等通过Stelic动物模型研究了小鼠肝脏基因表达和基因特异性DNA甲基化的改变，结果表明由异常DNA甲基化介导的微管蛋白β-2b链特异性过表达与NASH相关肝细胞癌的发生密切相关。微RNA(microRNA, miRNA)是内源性的小非编码RNA，在调节基因表达中起重要作用。
miRNA-122是肝脏中最丰富的miRNA，在肝细胞癌患者中表达下调，而其缺失会导致肝脂肪变性、肝炎和肝细胞癌的发生。
大量研究表明，miRNA-21、miRNA-29、miRNA-23、miRNA-155、miRNA-221、miRNA-222、miRNA-106、miRNA-93、miRNA-519通过转化生长因子β、Wnt/β-联蛋白(β-catenin)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，也被称为AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途径，调节细胞的增殖和能量代谢，促进NASH相关肝癌的发生。
此外，一些miRNA还可作用于PI3K/AKT途径的主要抑制因子——抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)，而PTEN低表达可导致小鼠出现脂肪变性和肝细胞癌。
二、脂代谢途径
1．脂质代谢失调：
脂质代谢重编程作为恶性肿瘤的标志近年来受到广泛关注。
传统上认为瓦博格效应(Warburg effect)是肿瘤细胞代谢的主要特征，糖酵解产能是癌细胞能量的主要来源。
近年来研究发现，肿瘤细胞之所以生长迅速且能快速适应各种环境，与其代谢重编程密切相关，其特征是细胞代谢改变和利于肝脏肿瘤发生的潜在毒性代谢物累积。
Björnson等对肝细胞癌组织和非癌肝组织进行了全基因组表达谱分析，发现肝细胞癌组织中参与脂肪酸生物合成的基因(如乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶)较非癌肝组织中普遍上调。
脂质代谢重编程对于肝细胞癌适应缺氧环境有重要作用。
当肿瘤细胞血供减少或快速增殖导致缺氧时，缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可通过下调中链酰基辅酶A脱氢酶和长链酰基辅酶A脱氢酶的表达来抑制脂肪酸β氧化，促进肝癌细胞的增殖和肿瘤生长。
此外，HIF-1α可通过下调长链酰基辅酶A脱氢酶从而降低PTEN的表达，促进肝细胞癌的细胞增殖。
Björnson等研究发现，缺氧条件下线粒体乙酰辅酶A合成酶1表达增加，其对乙酸的摄取能力和乙酸生成乙酰辅酶A的能力显著增强。
在缺氧条件下，线粒体乙酸酯可为肝细胞癌细胞增殖所需的脂肪酸生物合成提供原料，促进肿瘤细胞的增殖。
Iwamoto等研究发现抗血管生成药物诱发的缺氧可增加癌细胞对游离脂肪酸的摄入，增强其脂肪酸氧化作用，同时缺氧可激活腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化途径，将葡萄糖依赖性代谢转化为脂质依赖性代谢，即脂代谢重编程，从而刺激癌细胞增殖。
2．胰岛素抵抗：
脂滴在肝脏中聚积，活化核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，诱发胰岛素抵抗，胰岛β细胞释放胰岛素增加，导致高胰岛素血症。胰岛素抵抗和高胰岛素血症可增加胰岛素和胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)的表达。
胰岛素与胰岛素相关受体结合，调节细胞的生长、增殖，其中胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)是肝脏中胰岛素信号转导的主要介质。
典型的IRS信号通路包括IRS-1和IRS-2依赖性信号通路，通过活化MAPK级联反应通路和PI3K-丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)-AKT通路转导胰岛素信号。
MAPK信号通路通过诱导原癌基因c-fos、c-jun的转录来影响细胞生长，最终IGF-1激活Wnt/β-联蛋白信号级联反应，导致肝纤维化和癌变。
PI3K-PDK-AKT信号通路介导糖异生和糖原合成，活化的AKT通过磷酸化作用激活或抑制凋亡相关蛋白——B细胞淋巴瘤/白血病-2基因关联死亡启动子重组蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine-requiring aspartate protease 9，Caspase 9)，或通过核因子-κB抑制物激酶β(inhibitor of nuclear factor-κB kinase β，IKKβ)激活NF-κB下游基因表达，诱导细胞增殖和抑制细胞凋亡，在肝细胞癌的发生中起重要作用。
此外，胰岛素还可通过IRS-1触发信号级联反应，激活其下游PI3K/AKT/mTOR途径，通过其对细胞周期蛋白D1依赖性细胞周期、双微体同源基因2/抑癌基因p53依赖性细胞凋亡和mTOR依赖性细胞生长的影响来介导肝细胞癌的进展。
研究显示，IGF-1与多种肿瘤密切相关，其主要通过作用于IGF-1受体产生生物学效应，而胰岛素受体与IGF-1受体具有同族性，因此高水平胰岛素能够与IGF-1受体结合并直接活化IGF-1信号通路，促进肝癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡。
3．氧化应激和内质网应激：
脂毒性、胰岛素抵抗可进一步导致氧化应激和内质网应激，共同促进NASH相关肝细胞癌的进展。
在病理情况下，体内活性氧过度生成、抗氧化系统表达不足，导致线粒体DNA、脂质和蛋白质发生氧化修饰，诱发肝损伤并促进肿瘤的发生和进展。
线粒体是活性氧的主要来源，当肝脏中脂肪酸蓄积过多时，将导致新的脂肪生成和脂肪酸β氧化，产生活性氧。
活性氧可以通过激活MAPK途径和PI3K/AKT/mTOR途径促进肿瘤的发生和发展，此外还可通过降低蛋白酪氨酸磷酸酶和PTEN水平促进肝癌细胞增殖。
在癌细胞中，核因子E2相关因子2(nuclear facter erythroid 2-related factor 2，Nrf2)参与控制氧化应激和维持细胞存活和增殖，是细胞中与氧化应激反应密切相关的一种因子，可与细胞核内抗氧化反应元件的DNA序列结合，调控下游基因的表达，对抗氧化应激作用。
PI3K途径可激活Nrf2，通过保护癌细胞免受过度氧化应激而促进癌细胞存活；在肝细胞癌患者中，Nrf2表达上调，并与肿瘤大小、分化和转移有关，是一种潜在的预后标志物。
此外，体内活性氧、氧化应激、内质网应激和细胞死亡机制也存在显著的相互作用。
活性氧和氧化应激通过增加内质网储存钙的释放破坏内质网功能，过量的钙导致线粒体和溶酶体通透性增加，进一步增加线粒体活性氧的释放，激活内质网应激，导致肝脏脂肪合成与变性，造成氧化应激和基因的不稳定性。
内质网应激和氧化应激引起肝细胞脂毒性死亡和炎症介质的释放，进而导致肝细胞癌的发生。
三、免疫途径
肝细胞癌多发生于肝脏慢性炎症和肝纤维化的背景下，肝脏慢性炎症可促进免疫细胞释放多种细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-6、瘦素和脂联素，影响NAFLD相关肝细胞癌的进展。
TNF-α通过c-Jun氨基端N-terminal protein激酶(c-jun kinase，JNK)和IKKβ信号通路分别激活转录因子激活蛋白1和NF-κB使炎症信号通路磷酸化，导致细胞的炎症基因表达增加，并分泌更多的炎症因子，引发炎性级联反应。
大量研究证明，JNK和NF-κB通过肝脏炎症、肝细胞死亡和代偿性增殖促进肝癌的发生。TNF-α还可诱导肝前体细胞中Ras信号通路的激活和p53信号通路的失活，从而促进肝前体细胞的异常增殖和恶性转化，驱动肝癌的发生、发展。IL-6可激活信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，从而诱导细胞增殖，促进肿瘤细胞存活和血管生成。
在肝细胞癌祖细胞中，IL-6通过上调RNA结合蛋白Lin28抑制微RNA Let-7的表达，从而促进癌细胞增殖并抑制其凋亡，最终导致肿瘤的发生。
瘦素可促进免疫细胞分泌TNF-α、IL-6，进而启动促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)的细胞内信号级联反应，影响NASH相关肝细胞癌的进展。
此外，在肝细胞癌中，瘦素与其相应受体结合可激活JAK2/STAT3、MAPK和PI3K信号通路，同时可上调端粒酶逆转录酶，导致肿瘤细胞的永生化。
脂联素是一种抗炎细胞因子，主要由脂肪组织产生。
在正常生理条件下，脂联素通过激活JNK促进癌细胞凋亡，拮抗瘦素诱导的癌细胞增殖。
此外，当适应性免疫促进免疫监视以根除早期肝细胞癌时，适应性免疫细胞如CD8+淋巴细胞、辅助性T细胞17和B淋巴细胞等，也可刺激肝细胞癌发展。
CD8+淋巴细胞和CD4+淋巴细胞在NASH相关肝细胞癌进展中的潜在作用在动物实验中得到了证实。
有学者在小鼠实验中观察到，长期高脂并严重缺乏胆碱饮食通过激活肝内CD8+T细胞和自然杀伤T细胞影响NASH相关肝细胞癌的进展。
在预防性治疗中耗尽患有NASH而无肝细胞癌小鼠的CD8+T细胞和自然杀伤T细胞后，小鼠的肝损伤和肝细胞癌的发病率显著降低，表明CD8+T细胞和自然杀伤T细胞共同诱导小鼠肝损伤并能促进NASH相关肝细胞癌的发生，但其具体机制尚不明确。
在NASH患者中，亚油酸水平的增高可诱导线粒体活性氧的产生，促进CD4+T细胞的凋亡而损害肿瘤监测功能，引起肝细胞癌的发生。
此外，肝脏受损时可激活肝巨噬细胞，免疫激活后其表面Toll样受体与免疫原膜表面配体结合，促进多种细胞因子的释放，导致NF-κB、MAPK、胞外信号调节激酶1、p38、JNK和干扰素调控因子3信号通路的激活，最终在长期慢性炎症刺激下引起NASH相关肝细胞癌发生。
四、肠道菌群失调
肝脏通过门静脉循环直接暴露于肠道细菌和细菌代谢产物。
高脂饮食可导致肠道菌群失调，使有害菌增加、有益菌减少，进而导致肠道通透性增加和病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)的释放。
脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，被认为是PAMP的典型分子，从肠道转运至门静脉系统，依次激活肝细胞表面的Toll样受体和NF-κB，促进炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1α的释放，从而导致炎症和肿瘤的发生。
肠道细菌产物进入门静脉系统，作用于肝脏内的损伤相关模式或PAMP，通过Toll样受体或核苷酸结合寡聚域样受体激活肝星状细胞并使其转型为成纤维细胞。肠道细菌产物还通过单核细胞趋化蛋白/CC趋化因子受体2系统使肝巨噬细胞活化，继而促使肝星状细胞活化。
此外，肠道菌群失调可导致胆汁酸代谢改变、肝星状细胞衰老等促进肝癌的发生与进展。
正常情况下，胆汁酸大部分在小肠内被重吸收，并通过肝脏重新利用。
参与胆汁酸代谢途径的肠道菌群失调可使肠道中次级胆汁酸(如脱氧胆酸)水平异常升高，大量次级胆汁酸可通过门静脉进入肝脏诱发炎症反应，从而造成肝细胞损伤，进而导致肝细胞老化；老化的肝细胞可分泌促进癌变的蛋白质——衰老相关分泌表型，进而导致肝癌的发生。
Yoshimoto等的研究表明，抑制脱氧胆酸生成可抑制肥胖小鼠体内肝癌细胞生长。
Loo等的研究表明，肥胖诱导的小鼠肠道革兰氏阳性菌成分脂磷壁酸移位到肝脏，可与脱氧胆酸协同促进前列腺素E2对CD8+T细胞抗肿瘤免疫的抑制作用，导致肝细胞癌的发生。
五、结语
NAFLD和(或)NASH相关肝细胞癌的发病机制尚不明确，目前临床上尚无预防与监测NAFLD和(或)NASH是否进展为肝细胞癌的可靠手段和指标。
临床和基础研究结果显示，基因组不稳定性、异常脂质代谢、不受控制的氧化应激、免疫反应的激活和肠道菌群失调可能共同促进肝脏炎症、肝损伤和肝纤维化，在NAFLD和(或)NASH相关肝细胞癌的发生、发展中起着重要作用。
综合分析上述因素在肝细胞癌发生、发展中的功能分子靶点，有助于NAFLD和(或)NASH相关肝细胞癌的精准预防，以及新治疗策略的开发。
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